草鱼促性腺激素受体的克隆及表达分析

摘要：利用KT-PCK技术从草鱼性腺中克隆出两种促性腺激素受体基因（FSHR和LHR），采用N-J法构建了系统进化树。通过IVr-PCK及Keal-timePCR技术对FSHR和LHR在成体草鱼不同组织中的时空表达进行分析，发现和LHR在草鱼卵巢、精巢中表达明显，表达量随着卵母细胞的发育逐渐增高，以上结果为进一步探讨GTHR在鱼类生殖周期中的生理功能奠定了基础。

关键词：草鱼；促性腺激素受体；基因克隆；表达分析

中图分类号：Q785；Q786 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0039-05

MolecularGeneCloningandExpressionofGonadotropinReceptorsfromCtenopharyngodonidella

SHEDong-lian，CHENWen-juan，WANGYan-jie，ZHOUYi，LIUQiong，LIJian-zhong

（CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410081，Hunan，China）

Abstract：Twotypesofgonadotropinreceptors（FSHRandLHR）wereclonedfromthegonadsofgrasscarphyRT-PCR.Thephylogenetic*treeofGTHRbetweendifferentspeciesbyN-Jmethodwasconstructed.ThetemporalandspatialexpressionofdifferenttissuesinadultgrasscarphyRT-PCRandReal-timePCRwasanalyzed.TheresultindicatedthatFSHRandLHRweremuchhigherexpressedingonads，andtheexpres?sionlevelwassignificantlyincreasedinmatureoocytes.TheseresultslaidafoundationforthefurtherstudyonGTHRreproductivefunctionsinfish.

Keywords：grasscarp；gonadotropinreceptors；genecloning；expressionanalysis

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：039?043）

脊椎动物的生殖周期主要由下丘脑一垂体一性腺轴调控，而垂体分泌的促性腺激素（go-nadotropinhormone，GTH）在脊椎动物的生殖周期调控中占据中心地位，是促进性腺发育与成熟的关键性激素[1、2]。但是，促性腺激素必须与相应的受体结合才能行使其生物学功能，通过对促性腺激素受体（gonadotropinreceptors，GTHR）的研究有利于我们进一步了解GTH在鱼类生殖周期调控中的生物学功能[3]。在鱼类中，存在两种类型的促性腺激素受体GTHRⅠ和GTHRⅡ，――对应着哺乳动物中的促卵泡素受体（follicle-stimulatinghormonereceptor，FSHR）和促黄体生成素受体（luteinizinghormonereceptor，LHR）[4-7]。到目前为止，FSHR和LHR基因已经在日本鳗鲡japonica）、非洲鲶鱼（Clariasgariepinus）、斑马鱼（Daniorerio）、大西洋娃（Scdmosalar）、斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）、西氏拟隆头鱼（sieboldi）、牙汉鱼（Odontesthesbonariensis）等多种硬骨鱼[8-14]的性腺中被克隆，但在国内尚未见相关的研究报道。

草鱼（Ctenopharyngodonif/eWa）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科鱼类，是我国四大家鱼之一，是内地淡水经济鱼类中价值较高的优质鱼类之一。本实验室在草鱼脑垂体的起源和发生以及外源激素对草鱼脑垂体GTH细胞的影响等方面巳经做了大量的工作但是，在分子生物学方面，我们对草鱼生殖周期调控的分子机理还知之甚少，有必要进行深入的研究。本研究从分子生物学方面着手，对草鱼FSHR和LHR基因进行了克隆、表达及分析，对于进一步阐明促性腺激素及其受体在硬骨鱼类生殖周期调控中作用的分子机制，完善鱼类（特别是鲤科鱼类）的繁殖内分泌学研究有重要的理论意义。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

大肠杆菌E.coli DH5α湖南师范大学鱼类发育实验室保存，本实验所用草鱼来自本实验室养殖基地。

1.1.2试剂

无水乙醇、二甲苯、石蜡、甲醛、冰醋酸、苦味酸、苏木精、中性树胶（国产）；RevertAidFirst-strandcDNASynthesisKit、dNTP、TaqDNApoly?merase、DnaseI酶（美国Fermentas公司）；琼脂糖（西班牙BI0WEST公司）、胰蛋白胨、酵母提取物（0X0ID），焦碳酸二乙醋（diethylpyrocarbonate，DE-PC），氨苄青霉素、EB染液、DNA胶回收试剂盒（Sangon公司）；E.Z.N.A.To✈talRNAKitI（美国Omega公司）；pMD18-TVector，DNA纯化试剂盒（日本Takara公司）；SYBRqPCRMix（东洋纺生物科技日本有限公司）。实验中所用引物均来自于试剂盒本身附带或由Sangon公司合成，所有测序均由南京金斯瑞公司测序仪完成。

1.2方法

1.2.1目的基因克隆 用E.Z.N.ATotalRNAKitI试剂盒从草鱼脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、肠、卵巢、精巢等组织分离出总RNA，用RevertAidFirst-Strandc.DNASynthesisKit试剂盒以oligo-dT-3'Adaptor为引物合成cDNA的第一条链，根据已知草鱼的FSHR和LHR的开放阅读框序列，用PrimerPrimeier5.0软件设计FSHR和LHR特异性引物，用嵌套式PCR提高其特异性。3'RACE的特异引物为正向引物。

PCR扩增程序按如下程序进行：94～95T预变性3-5min；94-95℃，0.5-2min；37-70℃；，0.5～2min；70-750.5-1min；25-35个循环，最后70-75℃延伸5-10min。按UNIQ-10柱式DNA胶回收纯化试剂盒说明书进行PCR产物的纯化回收。将回收产物连接到PMD18-T载体上，将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行培养，提取质粒进行酶切鉴定，由南京金斯瑞公司测序，测序结果通过与引物拼接后，在NCBI上的BLAST（httpy/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行同源性物种比对，没有碱基差异，确定克隆序列为目的序列。

1.2.2系统进化分析

从GenBank中搜索日本鳗鲡、非洲鲶鱼、斑马鱼、大西洋鲑、斜带石斑鱼、西氏拟隆头鱼、牙汉鱼、小家鼠musculus）、鸡（Gallusgallus）和人（homosapiens）的GTHR序列，运用MEGA6.0软件以N-J法根据不同物种构建出FSHR和LHR的系统进化树。

1.2.3LHR和FSHR在草鱼成体不同组织的表达分析

将提取的脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、肠、卵巢、精巢等组织材料质量较好的RNA，按照1.2.1的步骤进行反转录过程，只需把3sitesAdaptorPrimer换成Oligo（dt）。以β-actin为内参作对照，按照1.2.1的反应条件和反应体系扩增表1的特异性引物后电泳检测。然后采用ABI7900HTReal-timePCRSystems进行荧光定量PCR，反应程序为95℃，2min；95℃，10min，之后进行30个循环（95℃，15s，60℃，45s）。设置在60℃，45s退火这一过程收集荧光。利用Livark等[17]提出的相对标准曲线法，对相对定量（relative quantification，RQ）结果数据进行分析，并用溶解曲线法检测PCR引物结合的特异性。

1.2.4LHR和FSHR在草鱼各发育时期的表达分析

将通过波恩试剂固定的卵巢材料进行鉴定后，取Ⅱ、Ⅲ、V期的雌性草鱼卵巢组织RNA，用RevertAidFirst-StrandcDNASynthesisKit试剂盒以Oligo（dT）18为引物合成cDNA的第一条链，根据已知草鱼的FSHR和LHR的开放阅读框序列设计合成Real-timePCR引物，引物如表2所示。然后再按照1.2.3的过程做Real-timePCR。

2结果与分析

2.1RACE扩增结果

提取草鱼性腺组织的总RNA，以反转录形成的CDNA为扩增模板，根据已知草鱼的FSHR、LHR的开放阅读框序列，用PrimerPrimeier5.0软件分析设计特异性引物，通过2次嵌套式PCR扩增出FSHR的3'端序列，结果如图1所示，其片段大小为390bp，在NCBI上经过Blast对比和同源性分析，证实获得的目的序列为草鱼促滤泡素激素受体FSHR的3'末端序列（草鱼FSHR在GenBank搜索序列号为KJ742829）。

2.2FSHR和LHR的系统进化分析

根据不同物种构建出的FSHR和LHR的NJ系统进化树分别如图2和图3所示，结果表明，草鱼的FSHR与斑马鱼、非洲鲶鱼的相似性最高，草鱼的LHR与斑马鱼的相似性最高。

2.3LHR和FSHR在草鱼成体不同组织的表达分析

草鱼的脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、肠、卵巢、精巢组织的总RNA提取结果如图4所示，以反转录形成的各组织cDNA为模板进行RT-PCR扩增，结果显示草鱼GTHR在肠、肾脏和性腺组织中特异性表达，如图5所示。

运用相对定量PCR技术比较LHR和FSHR在草鱼各组织中的特异性表达量，结果如图6和图7所示：在肠、肾脏、卵巢和精巢组织中特异性表达量分别为1、1.050、69.264和54.278；FSHR在肝脏、肾脏、卵巢和精巢组织中特异性表达量分别为1、1.105、68.788和60.368。数据显示在草鱼的肠、肾脏和卵巢和精巢组织中LHR的特异性表达量和草鱼肝脏、肾脏和卵巢和精巢组织中FSHR的特异性表达量相近，且LHR和FSHR在性腺组织中的表达量均远高于其他组织中的表达量。

2.4LHR和FSHR在草鱼卵巢不同发育时期的表达分析

运用相对定量PCR技术分析LHR和FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢组织中的特异性表达量，结果如图8所示：LHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢组织中特异性表达量分别为1、5.500、40.278；FSHR在Ⅱ、Ⅲ、V期卵巢组织中特异性表达量分别为1、8.688、58.368。结果表明LHR和FSHR的特异性表达量随着性腺的发育而不断增加，此外，两者在V期的卵巢组织中的特异性表达量明显高于Ⅱ、Ⅲ期卵巢组织中的特异性表达量，并且FSHR在卵巢组织中的特异性表达量比LHR高。

总之，本研究成功地克隆出了草鱼的FSHR和LHR基因。对组织表达特异性的RT-PCR的分析表明，草鱼的LHR在精巢、卵巢、肾脏和心脏组织中有表达，FSHR在精巢、卵巢、肾脏和肠组织中有表达，并且两者在性腺组织内的表达量比其他组织高很多，在对人类胚胎和成体时期的研究中也有关于LHR在性腺外的组织表达的记录，这说明促性腺激素受体可能对除性腺以外的组织有一定的作用[18]。该结果为进一步研究促性腺激素受体对非性腺组织的影响以及这种影响引起的生理意义奠定了基础。实时定量PCR分析表明了FSHR和LHR在草鱼卵巢组织中的特异性表达量随着卵母细胞的发育逐渐增高，并且在卵巢组织中的特异性表达量比LHR高。LHR和这种时空表达模式与其他鱼类在性腺组织中的表达是平行的这对于研究其他鱼类的表达模式具有一定的参考作用。系统进化分析表明草鱼与斑马鱼相似性最近，与其他鱼类的相似性也高于人、小家鼠和鸡，这与形态学上的系统进化分析是一致的。 [1]刘筠.中国养殖鱼类繁殖生理学[Ml.北京：中国农业出版社

（LIU Yun. China Farmed Fish Reproduction Physiology[M|.Beijing： China Agriculture Press）， 1993. 42-55.

[2]林浩然.鱼类生理学[M].广州：中山大学出版社（LIN Hao-ran. [12] Fish Physiology [Ml. Guangzhou： Sun yat―sen University Press），2011. 240-256.

[3]牛艳东.鳙鱼促性腺激素基因的克隆表达和序列分析[D].长沙：湖南师范大学（NIU Yan-dong. Cloning， expression and sequence analysis of gonadotropin subunits c.DNA in ihe big― [13] head carp （HypophthaLmichthys nob ills ）[D]. Changsha： Hunan Normal University）， 2009. 42-43.

[4]KUMAR R S， TJIRI S， TRANT J M. Molecular biology of thechannel catfish gonadotropin receptors： 1. Cloning of a functional luteinizing hormone receptor and preovulatory induction of gene expressionfj]. Biology of Reproduction. 2001. 64（3）： 1010- 1018.

[5]KUMAR R S， IJIRI S， TRANT J M. Molecular biology of thechannel catfish gonadotropin receptors： 2. Complementary DNA cloning，functional expression， and seasonal gene expres?sion of the follicle-stimulating hormone receptor[j]. Biology of Reproduction， 2001， 65（3）： 710-717.

[6]VISCHER H F， BOGERD J. Cloning and functional character?ization of a gonadal luteinizing hormone receptor complemenlary DNA from the African catfish（C/mas gariepinus）[J]. Biology of Reproduction， 2003， 68（1）： 262-271.

[7]BOGERD J， BLOMENROHR M， ANDERSSON E， et al. Dis-crepancy between molecular structure am] ligand selectivity of [171 a testicular follicle-stimulating hormone rec∞eptor of the African ratfish （Clarias gariePinus）[J]. Biology of Reproduction. 2001，64（6）： 1633-1643. [18]

[8]JENG S R. YUEH W S， CHEN G R， et al. Differential expres?sion and regulation of gonadotropins and their receptors in the Japanese eel （A ngiiilla j（if）onicn）[]＼. General and Comparative Endocrinology， 2007， 154（1）： 161 -173.

[9]VISCHER H F， GRANNEMAN J C， LINSKENS M H， et al. Both recombinant African catfish LH and FSH are able to activate the African catfish FSH receptoifj]. Molecular F.nflocrinolo- gy， 2003， 31（1）： 133-140. [201

[10]SO W K， KWOK H F， GE W. Zebrafish gonadtropins and their receptors： II. Cloning and characterization of zebrafish follicle stimulation hormone （FSH） and lut⌘einizing hormone （LH） subunits-their spatial -temporal expression patterns and receptor specificity [J]. Biology of Reproduction， 2005， 72（6）： 1382-1396.

[11]MAUGARS G， SCHMITZ M. Molec ular cloning and character?ization of FSH and LH receptors in Atlantic salmon （Scdmonsalar L）[J]. General and Comparative Endocrinology， 2006， 149（1）：108-117. [12]HU X， LIU X， ZHANG H. et al. Expression profiles of go-nadotropins and their receptors during 17a-methyltestosterone implantation―induced sex change in tlie orange―spoiled wmiper （Epinephelus coioides）[J]. General and Comparative Endocrinology， 2011. 172（6）： 268-276.

[13]KITANO H， IRIE S， OHTA K， et al. Molecular cloning of two gonadotropin receptors and their distinct mRNA expression profiles in daily oogenesis of the wrasse Pseudolahrus sieboldi[J] Biology of Reproduction. 201 1. 84（2）： 1 171-1 181.

[14]SHINODA T， MIRANDA L A， OKUMA K， el a！. Molecular cloning and expression analysis of FSHR and I .HR in relation to FSHR and LHR subunits during the period of teniferature-dependent sex determination in pejenev Odonteslhes Ijonaricnsis[J]. E✌ndocrinology， 2010.151（6）： 2349-2360.

[15]刘琼.鱼类促性，腺激素受体的研究进展[J].生命科学研究（LIUQiong.Progresses on the gonadotropin receptors in lish[J]. Life Science Research）. 2010， 14（2）： 263-267.

[16]鲁双庆，刘少军.草鱼性成熟前后垂体组织学和超微结构[J]. 湖南师范大学自然科学学报（LU Shuang-qing， LIU Shao- jun. Studies on histological and ultra-stmcture of the imma?ture and the mature AdenohyPoPhvsis ol Clenopharnigoflon Idellusf]]. Journal of Natural Science of Hunan Normal IJniversi- ty）， 1996， 19（3）：76-86.

[17]LIVARK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantilative PCR and the 2（- DeltaDelta C （T）） method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[18]GRZEGORZEWSKA A K. SECHMAN A. PACZOSKA-KI.IAS- IEWICZ H E， et al. The expression of pituitary FSH beta and LHheta mRNA and gonadal FSH and LH receptor mRNA in the chicken eml）ryo[J]. Biology of Reprodution. 2009. 9（3）： 253- 269.

[19]SEGAI.OFF D L. Regulatoiy proc-esses governing the cell surface expression of LH and FSH receptorslJ）. Suhcellular Bioclifm istry， 2012， 63（1）： 113-129.

[20]KANAMOR1 A， NAGAHAMA Y. Developmental changes in the properties of gonadolropin receptors in the ovarian follicles of amago salmon （Oncorhynchus rliodurus） during oogenesis[J]. General and Comparative Endocrinology. 1988. 72（1）： 25-38.

[21]LE G F， BRETON B. BOUGOUSSA M. Gonadolmpic hormone（GtH） receptors in the teslis of the trout salmo gaindneri：in vitro studies[J]. Fish Physiology and Biochemistry，1988. 5（4）： 209-217.