研究高密度脂蛋白胆固醇水平相关的遗传学
心血管疾病是威胁人类健康的最常见疾病, 其中冠状动脉疾病 在全球疾病死因中排名首位.血浆高密度脂蛋白胆固醇 水平与CAD的发生呈负相关, 多项前瞻性研究证实HDL-C水平每增加10 mg/L, 男性及女性的CAD发生率分别降低2%和3%[1].HDL颗粒具有多种抗动脉粥样硬化性质, 其防止CAD发生最主要的机制是促进胆固醇由外周向肝脏转移, 即促进胆固醇逆向转运 过程.RCT能够清除动脉壁巨噬细胞内的胆固醇, 有效防止泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块的形成.血浆HDL-C水平降低是CAD的独立危险因子, 也是临床评价心血管疾病发生的重要指标之一.因此, HDL-C水平的变化与CAD的发生和发展密切相关.研究已经证明血浆HDL-C水平具有显著的遗传基础, 遗传率达到40%~60%.本文就将重点围绕HDL-C水平相关的遗传学最新进展做一综述, 揭示影响HDL-C水平的主要遗传性因素, 以期为CAD治疗提供新思路及新的作用靶点.
1 高密度脂蛋白 的结构、产生及代谢
HDL是循环中体积最小、密度最大的脂蛋白, 也是一类组成、密度、颗粒大小极不均一的脂蛋白, 主要由肝和小肠合成.双向电泳-免疫印迹法显示, HDL可分为贫脂圆盘状的pre--HDL 和富脂球形的成熟-HDL [2].多数HDL颗粒具有一个胆固醇酯 的疏水核心, 外周包围着少量以单层磷脂形式存在的甘油三酯 .载脂蛋白AⅠ 是HDL中含量最丰富的脂蛋白, 约占总脂蛋白成分的70%.三磷酸腺苷结合盒转运体A1 是一种膜整合蛋白, 通过与Apo AⅠ结合, 促进细胞内胆固醇流出, 形成圆盘状的新生HDL[3] .我们的研究[4]证明, Apo AⅠ能稳定ABCA1, 上调其表达, 不仅增加细胞内胆固醇流出, 减少胆固醇聚集, 也有利于新生HDL的形成, 提示Apo AⅠ与HDL的抗动脉硬化作用密切相关.卵磷脂胆固醇酰基转移酶 能酯化新生HDL颗粒表面的胆固醇 , 使之形成疏水性的CE转入HDL颗粒核心, CE不断聚集即形成成熟的球形HDL.Apo E作为成熟HDL颗粒的重要组成成分, 促进HDL与胆固醇结合, 使HDL更易被肝脏识别, 有利于肝脏清除富含胆固醇的HDL .而B类Ⅰ型清道夫受体 是第一个被证实的细胞表面HDL受体, 能促使HDL-CE进入肝脏分解代谢[5] .由此HDL就将肝外细胞释放的胆固醇转运至肝脏, 从而防止胆固醇在血中聚积, 减少动脉硬化的发生.此外, HDL中还包含抗氧化成分及血浆脂质代谢相关酶类, 如✞胆固醇酯转移蛋白 、磷脂转移蛋白 和对氧磷酶1 等, 都与HDL的代谢及功能密切相关.
CETP属于脂转移/脂多糖结合蛋白家族成员, 是一种疏水性的糖蛋白, 能够介导CE和TGs在HDL与低密度脂蛋白 或极低密度脂蛋白 之间的交换, 从而调节血浆HDL的浓度、组成和颗粒大小[6] .有研究发现CETP缺乏不仅造成大颗粒HDL的出现, 还会导致严重的高HDL-C水平现象[7].PLTP与CETP同属于一个蛋白质家族, 主要介导HDL和VLDL间及不同的HDL颗粒间磷脂的转移 .CETP作用产生的富含TG的HDL可以作为肝酯酶 的作用底物, HL由肝细胞合成, 能水解HDL2b中的TGs, 使之转变成HDL3 .HL缺乏将导致HDL颗粒中TGs富集及HDL-C水平升高[8].内皮酯酶 主要水解HDL中的磷脂, 促使HDL2向HDL3转化 , 而脂蛋白酯酶 主要参与VLDL和HDL之间载脂蛋白和磷脂的转换 , 二者都通过影响HDL代谢来调节HDL-C水平的变化.
DL:高密度脂蛋白;HL:肝酯酶;EL:内皮酯酶;AⅠ:载脂蛋白AⅠ;AⅡ:载脂蛋白AⅡ;E:载脂蛋白E;C:载脂蛋白C;FC:游离胆固醇;BCA1:三磷酸腺苷结合盒转运体A1;CETP:胆固醇酯转移蛋白;LCAT:卵磷脂胆固醇酰基转移酶;PLTP:磷脂转移蛋白;LPL:脂蛋白脂酶;DL:低密度脂蛋白;VLDL:极低密度脂蛋白;SR-BⅠ:B族Ⅰ型清道夫受体;LDLR:LDL受体;LRP:LDL受体相关蛋白.
2 HDL-C水平相关的遗传学研究
影响HDL水平的因素大致可以分为两类, 即遗传性因素和ฉ环境性因素.流行病学研究显示, 性别、年龄、肥胖、吸烟、饮酒、饮食、体育运动、药物或其他代谢异常 等环境性因素会影响HDL-C水平, 其中, 肥胖与血浆HDL-C水平的降低关系最为密切.有数据表明体重每减少1 kg, 血浆HDL-C水平增加3.5 mg/L, 原因可能与LCAT和LPL活性增强及RCT过程的改善有关[9].饮酒同样影响HDL-C水平, 每天摄入酒精30~40 g或40 g以上会增加HDL-C含量, 其原因可能是ABCA1、Apo AⅠ和PON1水平增加, CETP水平降低以及酒精的心脏保护作用等导致HDL-C水平的改变[9].虽然环境性因素对HDL-C水平的影响不容忽视, 但研究已经证明血浆HDL-C具有显著的遗传基础[10], 且其遗传十分复杂, 可能是单基因遗传或多基因遗传的综合效应, 提示遗传性因素是HDL-C水平高低的决定性因素.
2.1 HDL-C的单基因遗传学研究
2.1.1 低HDL-C水平相关的单基因缺陷.
最常见的低HDL-C相关的遗传病是家族性低脂蛋白血症 , 表现为HDL-C、Apo AⅠ含量降低及早发性CAD.研究表明, ABCA1基因变异与FHA密切相关[11], 但HDL-C水平降低则是多种遗传因子的共同作用.
a.ABCA1.ABCA1基因定位于9q31染色体上, 其突变引起丹吉尔病 , 即家族性脂蛋白缺乏症, 这是一种罕见的常染色体隐性遗传病, 以HDL-C及Apo AⅠ水平显著降低为主要特征, 同时伴有TGs水平增加和LDL-C水平降低[12].ABCA1突变即ABCA1途径缺失使细胞内胆固醇不能转运至贫脂或无脂的Apo AⅠ, 导致新合成的Apo AⅠ迅速降解, HDL水平低下, 外周细胞胆固醇严重蓄积.根据胆固醇蓄积的不同组织及部位, 其临床症状表现为橙-黄色扁桃体增生、肝脾肿大、角膜浑浊, 皮肤呈非特异性丘疹或黄瘤样病变, 在大脑则导致淀粉样蛋白蓄积, 与阿尔兹海默病的发生密切相关, 血液学检测发现有白细胞及血小板减少现象[13] .ABCA1突变的杂合子可能引起FHA, 表现出HDL-C水平下降及大颗粒HDL减少, 这主要由于胆固醇流出量减少仅为正常水平的50%, 而胆固醇流出的下降往往又导致颈动脉内膜内侧增厚, 并可引起CAD的发生[14].
b.Apo AⅠ.染色体畸变或缺失等会导致Apo AⅠ完全性缺乏, 引起HDL-C水平显著降低及早发性CAD, 其显著特征表现为患者血浆中无Apo AⅠ, 但LDL-C和TGs含量正常, 并伴有黄瘤及角膜浑浊症状 .Apo AⅠ基因突变杂合子血浆中HDL-C及Apo AⅠ水平是正常者的一半, 但并无明显的临床症状[13].Apo AⅠ基因变异的影响多样, 多项研究证实Apo AⅠ基因变异相比其他基因的变异更容易引起早发性CAD , 但也有调查发现Apo AⅠ突变体人群中老年人并无CAD症状, Apo AⅠ的两种突变体 能降低心血管疾病的危险率[15], 赵庆伟等[16]还发现Apo AⅠ启动子的一种常见变异 能增加HDL-C水平, 但具体机制还未完全阐明.
c.LCAT.LCAT完全性缺乏导致家族性LCAT缺陷 , 而LCAT部分缺乏, 即仅HDL中LCAT缺陷则导致鱼眼病 .LCAT分为-LCAT和-LCAT两类, -LCAT活性作用于含Apo B的载脂蛋白, -LCAT活性则作用于HDL.FLD表现为两种LCAT活性缺陷, FED仅表现出-LCAT活性缺陷[17].研究已经鉴定出多种LCAT突变体, LCAT缺乏导致血浆及外周组织中游离胆固醇不能转变成CE而显著增加, 使得成熟HDL颗粒无法形成, 血浆中圆盘状HDL、Apo AⅠ清除加快[18], 因而HDL-C及Apo AⅠ水平降低, 同时TGs水平升高, LDL-C水平降低, 红细胞中胆固醇含量增加诱发溶血性贫血, 此外还有角膜浑浊、肾功能不全等临床症状[13] .LCAT突变杂合子临床表现正常, 但常表现出低LDL-C水平现象.
d.LPL.LPL缺乏导致Ⅰ型高脂蛋白血症, 又称家族性乳糜微粒血症, 是一种比较罕见的常染色体隐性遗传病, 由于乳糜微粒和VLDL蓄积, 导致严重的高甘油三酯血症, 而LDL-C及HDL-C水平则极低, 临床表现为肝脾肿大、黄瘤、急性胰腺炎的循环发作等[19] .LPL突变杂合子中TGs水平升高, HDL-C水平降低[14].LPL的活性通常与HDL水平呈正相关, LPL缺陷个体中由于LPL不能激活而损伤无脂或贫脂前体的产生及成熟, 导致HDL-C水平降低[20].LPL与胆固醇流出活性也呈正相关, 有研究表明LPL缺陷导致胆固醇流出明显减少, 但CAD的发生率并未提高[21] , 提示LPL对动脉硬化的发生可能具有双重作用, 有待深入研究.
2.1.2 高HDL-C水平相关的单基因缺陷.
血浆HDL-C水平降低是CAD的危险因素之一, 但高HDL-C水平并不一定具有心血管保护作用, HDL-C水平升高会引起的家族性高脂蛋白血症, 主要表现为HDL-C水平高于正常同龄同性别人群HDL-C水平的90%, 有家♋族性高HDL-C史.引起家族性高脂蛋白血症的遗传因子很多, 但大多数易感基因还未证实.
a.CETP.CETP基因突变引起CETP缺乏, 显著升高HDL-C水平, 杂合子中HDL-C水平仅少量升高, LDL-C水平大体正常.CETP在HDL由大颗粒重构为小颗粒的过程中发挥重要作用, 在高甘油三酯血症条件下, CETP转移TGs的效率提高, 导致HDL颗粒中TGs积蓄加快, 而胆固醇相应减少, 这种HDL颗粒会迅速被肾脏清除, 引起循环中HDL-C水平降低;而缺乏CETP导致HDL2中的CE不能转移至VLDL, 进而HDL-CE含量升高, 即大颗粒的HDL2含量增加, 但Apo AⅠ和Apo AⅡ水平降低[22,23] .CETP缺乏是造成高脂蛋白血症的最主要原因, 但其与CAD的关系还存在争议 , 有研究显示CETP缺乏的患者CAD发生率降低[24], 但有报道表明CETP缺乏而增加的HDL-C存在功能障碍[25], 也就不具有相应的心血管保护作用.
b.HL.人类肝酯酶基因 位于15q21-23染色体, LIPC突变可能是一种常染色体隐性遗传, 极为罕见.HL缺失患者表现为Ⅲ型高脂蛋白血症, 以严重的高甘油三脂血症为主要临床特征, 胆固醇及中密度脂蛋白水平也明显升高[13].该病患者表现出血浆HL活性显著降低, HDL-TG大量增加, HDL-C、Apo AⅠ水平、大颗粒HDL水平增加, 以及脂蛋白残粒分解代谢异常[26] .LIPC突变杂合子并不表现出脂蛋白代谢异常.HL缺失患者伴有早发性CAD, 可能由于致动脉粥样硬化脂蛋白含量增加所致 .最新研究表明, HL缺失可能导致动脉硬化易感性增加[27], 但HL对动脉粥样硬化的具体作用还有争议, HL活性过高或过低都可能提高动脉粥样硬化的发生率.
2.2 HDL-C的多基因遗传学研究
通过先前的研究已经成功鉴定出多种影响HDL-C水平的易感基因, 但HDL-C水平的变化往往不是由于单个基因变异导致, 而是多个基因综合作用的结果, 因此, HDL-C的多基因遗传学研究十分必要.目前主要的研究手段分为两大类:候选基因关联分析及全基因组研究, 前者主要采用基因关联和筛查测序的方法, 后者主要以全基因组关联 研究为主.
2.2.1 候选基因分析研究.
候选基因研究采用基因关联或筛查测序的方法, 以假说为基础, 综合流行病学、病因学, 通过结合组织表达特异性、功能分析及与已知功能基因的同源比较, 搜寻可能与其发病有关的候选基因, 进而确认基因内或邻近基因中引起这些基因功能或表达改变的突变, 或对引起功能改变的突变形成连锁不平衡的多态性进行关联研究, 是研究多基因疾病与遗传因素之间可能致病通路的第一步.全基因连锁扫描HDL-C水平及其相关特征 已经应用于FHA以及不同种群的家族样本.
2002年Yamada等[28]在《新英格兰医学杂志》 上发表的对心肌梗死 遗传因素的研究中, 首先就71个候选基因共112个多态性进行测序筛查及回归分析选出19个相关的遗传多态性, 再对其开展进一步的大样本量研究, 最终成功鉴定出3种基因多态性与MI风险性显著相关, 表明候选基因分析在多基因疾病遗传因素研究及风险性预测方面的重要作用.通过以往的研究已经鉴定出影响HDL-C水平的易感基因, 其中CETP、LPLPL和LIPC的变异最为常见.新近研究发现LIPC启动子250G/A突变可能导致HDL-C水平升高[29].全基因组单核苷酸多态性 相关比较研究及早期的候选基因研究进一步揭示了LIPC基因的SNPs与高HDL-C水平相关, 研究显示LIPC启动子SNP 能使HDL-C浓度增加15 mg/L[30].对大量高HDL-C水平受试者的数据统计得出CETP的3种变异体rs708272、rs5882和rs1800775[31], 说明CETP基因变异对HDL-C水平也有重要影响.候选基因研究还发现LPL的7种SNPs与HDL-C水平有密切联系, 其中4种SNPs有很强的连锁不平衡性[32], 且rs328能增加HDL-C, rs268及rs1801177则导致HDL-C减少.
PLTP和EL都与HDL的重构密切相关, 动物实验证明PLTP缺乏导致HDL-C水平下降, 但在低HDL-C的人群中PLTP突变并不常见.Aouizerat等[33]研究显示, 已发现PLTP的4种错义突变中仅有一种突变 导致其转移活性降低, 与低HDL-C水平相关;其研究还鉴定出PLTP基因内含子的一种SNP 能升高HDL-C水平, 这一结果在Engler等[34]的研究中也得到了进一步验证.生化和动物实验都已证明EL缺乏和过表达会影响HDL-C水平.近期的一项研究发现抑制编码EL的基因LIPG可能是增加HDL-C水平的有效途径[35].体外脂肪酶活性检测也表明高HDL-C变异体中EL活性降低, 进一步证实EL对HDL-C的影响.此外, 我们对HDL生成的限速基因ABCA1的研究中发现, 其存在的一种常见变异R219K与HDL-C水平降低有关, 且ABCA1R219K不同基因型和等位基因频率分布存在种族和个体差异[36], 提示对不同种族人群HDL-C水平相关的遗传学研究中, 应同时考虑不同基因型和等位基因频率分布的影响.
Apo A1-C3-A4-A5基因簇也是HDL-C相关的候选基因, 其位于11q23染色体上, 其中Apo A5和Apo C3都主要存在于HDL及富含TGs的颗粒中, Apo A5能激活LPL, 而Apo C3则抑制LPL活性.已证明Apo C3基因座与HDL-C水平有关, 但相关研究结果存在争议, 而Apo A5的多数基因突变都引起HDL-C水平降低, 新近研究中证实Apo A5基因-3A/G SNP能影响血脂水平, 导致HDL-C水平下降[37].Apo E也能影响HDL-C水平, 其中Apo E2基因突变增加HDL-C水平, 而Apo E4的突变体则降低HDL-C水平[38].最近有研究就Apo A1-C3-A4-A5基因簇和它们的单体型与血脂水平的关系进行探讨, 发现所研究的5种SNPs构成的单体型比单个的SNP可解释更多的血脂参数异常, 提示分析血脂相关基因单体型与血脂水平的关系更有临床价值[39].
近期Peloso等[40]研究发现2种低HDL-C水平的新型易感基因, 即编码吞饮受体 和视黄醇类X受体 的基因, 分别对应的2种突变体rs7893395和rs11185660, 会引起HDL-C增加和CAD发生率提高.其研究还进一步证实P选择素 基因变异可通过影响HDL-C水平而引起CAD危险性提高[40].调节HDL代谢的另一种新型基因WWOX编码的蛋白包含两个N端的WW结构域和一个C端的短链氧化还原酶位点.有研究证明[41], Wwox缺乏的小鼠类固醇合成途径受损, 且血清脂质水平异常, 表现出高胆固醇血症, 四周龄时就出现死亡, 但Wwox影响HDL-C水平的具体机制还未阐明, 有待进一步研究.
此外, 有报道证实内皮缩血管肽-1 第198个密码子处发生氨基酸替换 产生的变异体rs5370与HDL-C水平相关[42].SR-BI也是候选基因研究的热点, 动物实验证明它能影响HDL-C水平及对CAD的敏感性, 已经鉴定出几种SR-BI基因的突变, 该突变往往导致HDL-C水平升高和LDL-C水平降低[43], 但不同突变体的作用不尽相同, 还与性别等因素相关.
2.2.2 全基因组关联研究.
全基因组关联 研究是指在全基因组层面上, 开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究, 是通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记, 如SNP或拷贝数变异 等分型, 从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法.其中最小等位基因频率 , 已广泛应用于复杂疾病的GWA研究, 它通常是指在给定人群中不常见的等位基因发生频率.在关联研究中, 较小的MAF将会使统计效能降低, 通常在研究人群中罕见突变与疾病的关联时通过加大样本量的方法来弥补MAF降低所带来的统计效能的损失, 已知MAF还能估算样本量或检验效能, 并确定基因型频率.与以往的候选基因研究策略不同, GWA研究不需要在研究前构建任何假设, 但关联分析的结果往往需要进一步的功能验证, 如等位基因的不平衡表达 等才能更好地解释致病机制.
2007年Helgadottir等[44]在《科学》 杂志上的报道以白种人样本为基础, 第一阶段应用基因芯片进行大样本量的全基因组扫描, 筛选CAD相关位点, 然后就其中最显著位点进行重复验证及精确定位, 得出9p21是CAD相关的易感位点.同时一系列有关肥胖、冠心病以及相关表型如TG、HDL-C等的GWA研究也被陆续报道, 显示出GWA研究在复杂疾病易感基因定位及发掘相关新型基因变异上的巨大潜力.目前, GWA研究已经鉴定出许多血浆脂质及脂蛋白异常的易感基因, 但多以欧洲白种人为研究对象, 近期Liu等[45]选取其中9个基因座进一步分析, 证实GWA研究中得到的脂代谢相关变异在中国的汉族人群中也起重要作用, 且其中的4种突变体 与HDL-C水平相关.最近Manichaikul等[46]进行的同期组群GWA研究发现CETP突变体 与HDL-C水平升高的关系极为密切.Sarzynski等[47]对GWA研究为基础的3种候选基因 进行检测, 发现CETP的一种突变体rs3764261对HDL-C水平变化的影响最为显著 , 提示CETP基因的多种突变都能影响HDL-C水平, 可能成为相关疾病防治的重要靶点.
脂肪酸去饱和酶 基因簇FADS1-2-3可影响HDL-C水平 , 该基因座的SNPs能调节FAD1和FAD3的表达, 二者表达增加导致HDL-C水平升高及TGs水平降低[48].由于FADS与多不饱和脂肪酸 生物合成途径相关, 饮食中的-3PUFA, 作为FADS1的底物也可降低血浆中的TGs, 增加HDL-C, 有研究显示通过此机制还能降低肝脏VLDL和TGs♂水平[49].此外, GWA研究也对ABCA1、LCAT、PLTP、LPL、LIPC、Apo A1-C3-A4-A5等许多已知HDL-C相关基因进行了验证[50,51], 有助于我们全面了解各个基因对HDL-C水平的影响.
血管生成素样蛋白4 作为一种分泌蛋白, 能使LPL由具有催化活性的二聚体变为无活性的单聚体, 从而抑制LPL活性, 其在小鼠体内的过表达能引发严重的高甘油三酯血症.研究发现ANGPTL4的E40K变异体与低TG、高HDL水平密切相关[52] .ANGPTL4也可作为血清中的一种激素, 通过LPL外的其他机制影响HDL-C水平.
还有研究发现肝细胞核因子4 的一种低频非同义变异体rs1800961对HDL-C也有极其重要的影响[48] .HNF4能调控多种脂质代谢相关基因的表达, 包括载脂蛋白、固醇合成酶及胆汁酸转运体等.小鼠HNF4的靶基因突变降低LDL-C和HDL-C水平, 并导致小颗粒HDL及贫脂型的出现[53];人类HNF4的靶基因突变引起Ⅰ型青少年发病的成人型糖尿病 [54], Ⅰ型MODY是Ⅱ型糖尿病 的一种早发性常染色体显性疾病, 患者血清Apo AⅠ、Apo AⅡ和HDL-C水平降低.
Aulchenko等[55]的研究中发现, 2种新型基因 与HDL-C水平相关, 其多种SNPs都导致血浆HDL-C水平发生变化.GALNT2✪基因编码N-乙酰半乳糖氨基转移酶2的合成, 也是GWA研究确定的一种新型HDL相关基因, 研究发现其首个内含子的SNPs与HDL-C和TGs水平相关[56] .GALNT2在脂质代谢中通过蛋白质糖基化间接影响HDL-C和TGs.有研究表明, GALNT2在肝脏中的过表达使HDL-C水平降低, 相反GALNT2敲除则剂量依赖性地使HDL-C水平增加[57], 但其具体机制尚未阐明.
期一项GWA研究[47]又得到MVK和MMAB2种新型候选基因与HDL-C水平密切相关, 二者定位于染色体12q23~24, MVK编码甲羟戊酸激酶, 催化类异戊二烯生物合成途径的早期过程;MMAB编码钴胺素腺苷转移酶, 在腺苷钴胺素合成中发挥作用.研究中通过检测与已知基因的AEI相关性证明, 在此基因座处MMAB基因对HDL-C水平的影响更为显著 , 但二者在HDL代谢中的确切功能还有待研究.此外, MVK和MMAB2种基因都受固醇应答元件结合蛋白 调控, 最新研究[58]已经证实SREBPF基因存在一种错义突变 能引起HDL-C水平的下降.
3 小结
研究已经证实高LDL-C水平和低HDL-C水平都是引发CAD的主要诱因.过去人们更多地将防治CAD的焦点放在降低LDL-C水平的研究上, 例如使用他丁类药物, 而流行病学研究表明HDL-C水平降低已经成为CAD发生的主要独立危险因素和显著特征, 提示HDL-C水平与CAD的发生密切相关.HDL-C的影响因素有很多, 包括年龄、性别、吸烟、饮酒等环境性因素, 但遗传因素的影响占主导地位.近年来, 随着GWA研究方法的引入, 使对遗传流行病的发病预测不再停留在传统的环境性因素分析, 而是通过对人体的全基因组分析, 找出可能导致今后发病的基因, 并结合环境性因素, 得出多种流行病的发病率, 为HDL-C水平相关的遗传因素研究, 尤其为多基因的遗传学研究提供了极大便利.运用综合性的方法继续深入对HDL-C水平变化的关联性研究, 探索其遗传率的影响因素, 有助于全面了解影响CAD发生、发展的遗传基因, 对寻找防治新靶点及新途径将具有非常重要的意义.
