微生物来源a―L―鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

摘要：a-L-鼠李糖苷酶（a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））是一种水解酶，分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族，其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的（α/α）6桶状结构，它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基，在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用，主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。

关键词：α-L-鼠李糖苷酶；基因克隆；基因表达；晶体结构

中图分类号：Q71；Q786 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0068-07

ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources

ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.2’3，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3

（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，Fujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，Fujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，Fujian，China）

Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r

hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate―activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r

hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.

Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）

α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷（naringin）、芦丁（rutin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖秆酶。目前关于动物组织[2]和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌（如芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属及单胞菌属等）和真菌（如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等）发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质存在差异。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内，主要在4.0～7.0[3-5]之间。微生物中的α-L-鼠李糖秆酶的最适反应温度一般是45?60℃[4、6]。近年来也有发现耐热、嗜低温及耐碱性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保温1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]产生的α-L-鼠李糖苷酶最适温度为70℃，在60℃处理24h后酶活为处理前的20%；而亚南极环境中的单胞菌属细菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等从白黄笋顶孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分离到一种新型碱性α-L-鼠李糖苷酶， ☹以对硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）为底物测得酶反应的最适pH值为8.0，它可以在碱性条件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物质，扩大了α-L-鼠李糖苷酶的应用范围。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧类果汁苦味的有效物质[1]。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苻酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，Chien[10]等用HPLC法证明仅有柚苷酶的另一组份β-D-葡萄糖背酶存在时，苦味物质抽皮苷是不能被水解的。有研究报道，对葫溪蜜柚果汁进行脱苦时，在α-L-鼠李糖苷酶加量为10U/mL的条件下40℃处理60min，苦味就能降低到阈值以下[11]。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味[3、12]，在其他行业也具有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖[1]和普鲁宁降低黄酮类化合物的生产成本；增加酿造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和饮料的香气成分；切除一些糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研究开发。本文分别对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达以及该酶的晶体结构研究进展进行了阐述。 1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物学研究

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代生物技术来研究α-L-鼠李糖苷酶是一种必然趋势

1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

早期对a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是该酶的分离纯化及酶学性质，2000年后对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日渐增多，表1列举了2000年以来微生物中GH78家族和近两年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，从微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和构建文库的方法。据PuriM等报道，采用构建文库的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通过以下两种方法筛选阳性克隆；一种是利用pNPR作为底物筛选含有α-L-鼠李糖苷酶活性的阳性克隆；另外一种是采用多克隆抗体筛选产鼠李糖苷酶的阳性克隆。

细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有学者报道对Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些细菌中存在多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它们的序列存在差异，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB两个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们分别编码两个不同的α-L-鼠李糖苷酶。来自植物乳酸杆菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们的序列相似性仅为26%。不同细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各异，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB与Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分别为41%和23%。植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2与Bacillussp.GLl[31]中该蛋质（登录号：BAB62315）的氨基酸序列相似性均为23%，与ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登录号：AAR96047）相似性分别为22%和23%。而少动鞘氛醇单胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354个核苷酸，同源性比对发现它与其他属于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因没有显著的同源性。

国外关于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在来源于曲霉属的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉属中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和构巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究报道。对目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析发现，不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差异较大。从棘孢曲霉[19]中克隆的两种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列几乎没有相似性，二者氨基酸序列相似性为60%，而它们与Clostridiumstercorarium中该酶的氨基酸序列[18]的一致性仅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列与棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分别为75%和67%，与细菌[7、18、20、21]来源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在着多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分离到两种α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它们对应的基因：有研究者对构巢曲霉[29]的基因组信息进行分析发现，至少存在8个可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE两种：我国学者对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相对较晚，主要是对犁头霉属[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因cDNA片段[32]和人参皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者从黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，该序列和α-淀粉酶的序列有较高的同源性，被归类到糖苷水解家族GH13。此外，笔者巳经从黑曲霉JMU-TS528（集美大学生物工程学院发酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共编码655个氨基酸，序列已上传至NCBI数据库（登录号：KC750908.1），经同源性比对发现，它与白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。

虽然对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的报道越来越多，但对该基因在转录水平上的调控研究并不多。目前，仅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表达量受诱导碳源的影响，葡萄糖在转录水平抑制该基因的表达。因此，笔者认为今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基础上进一步鉴定与该基因跨膜转移或翻译直接相关的基因和蛋白，阐明葡萄糖抑制基因与α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的关系，从而明确碳源代谢调控α-L-鼠李糖苷酶基因的机制。

1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表达

通过α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生产普鲁宁可以降低普鲁宁的生产成本，但目前报道的α-L-鼠李糖苷酶大多数是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的过程中，普鲁宁作为一种中间产物，会进一步被分解成柚皮素，不能大量积累普鲁宁。所以表达出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质具有重要的应用价值。近几年有人对α-L-鼠李糖苷酶基因的表达进行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表达出的具有活性的蛋白。

在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表达时，大肠杆菌是研究者常用的表达宿主。虽然采用原核表达系统来表达真核微生物中的基因容易出现没有活性的产物，目前已有不少研究者将微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通过大肠杆菌表达出有活性的蛋白。如Jules[22]等将植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表达出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，达到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表达后产物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表达系统成功表达出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特异性水解橙皮苷和芦丁糖，两种酶均不能水解柚皮苷，以pNPR为底物测得Ram和Ram2的酶活分别为8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸杆菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表达的RhaBl和RhaB2能特异性地水解α-1，6糖苷键，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷键，RhaB1和RhaB2的最适底物是橙皮苷和芦丁。有研究者发现有些细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因表达后的产物是二聚体，例如Clostridium stercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）细胞中表达出的蛋白Ram78A包含两个相同的亚基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表达出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚体形式存在。 由于原核表达系统本身存在的一些缺陷，有时表达出的α-L-鼠李糖秆酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表达系统来表达α-L-鼠李糖苷酶基因。目前对α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达的报道并不多，我国研究者已在酵母中成ซ功表达了芦丁鼠李糖苷酶基因[36]、人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列与α-淀粉酶基因序列相似性较高，通过酵母表达后的产物具有水解芦丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母细胞表面展示技术将Alternaria sp.L1[28]中rhal1编码的α-L-鼠李糖苷酶固定在酿酒酵母细胞表面，该细胞能特异性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷达到果汁脱苦的作用。RhaL1固定在酿酒酵母细胞表面后，该酶在70℃环境中活性很高，在60℃处理2h后酶活达到处理前的95%，扩大了该酶在工业生产中的应用范围。目前对黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的异源表达研究较少，笔者正在研究从黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达。国外的研究者报道了土曲霉[25]、构巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表达。鼠李糖能够诱导构巢曲霉[29]中rhaE的表达，葡萄糖对该基因的表达产生抑制作用，rhaE在酿酒酵母中表达的产物，能够水解底物pNPR，酶活达到1.4U/mL。通过系统发育树分析发现，在真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首个与细菌中α-L-鼠李糖苷酶基因亲缘关系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表达系统得到的产物和天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶一样，都可以水解芦丁，重组酶酶活力高达9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大缩短了天然发酵获取α-L-鼠李糖苷酶的时间，同时酶的产量比天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。尽管近年来，利用基因工程技术来构建产α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐渐增多，并取得了一定的进展，但酶活水平始终未能达到工业化应用的要求；目前国际上对α-L-鼠李糖苷酶分泌机制的研究也不多，因此如何进一步提高该酶的胞外分泌水平，是该酶能否得到推广应用的关键：

2α-L-鼠李糖苷酶的结构生物学

蛋内质需要形成一定的空间结构才能有活性，近年来，虽然对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表达的报道很多，佴对它的结构方面的研究报道还比较少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通过圆二色谱法测得该酶二级结构包含27%的α-螺旋和50%的β-折叠结构。

CAZy（http：//www.cazy.org/）数据库依据氨基酸序列相似性对糖苷水解酶类进行了分类，微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB数据库可以搜到3个鼠李糖苷酶的晶体结构，分别是来自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶体结构，该酶由N、D1、D2、C和A5个结构域组成；结构域A包含其（α/α）6的桶状结构，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在该酶的催化作用和底物结合方面起到了关键作用，它们与鼠李糖相互作用，将其突变后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并认为RhaB的空间结构与Lactobacillusbrevis菌株的麦芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的壳二糖磷酸化酶ChBP的结构相似。来自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶体结构有两种，一种是原蛋白形式，另外一种是包含L-鼠李糖的晶体结构，这两种形式的结构变化很小，RMSD值仅为0.21A，它们均由1个α和5个β结构域组成，分别是N、D、E、F、A和C；结构域A包含（α/α）6的桶状结构，与Cui[31]等报道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13个α-螺旋组成，结构域N包含10个β-折叠，结构域D的11个β-折叠和E的13个β-折叠展现出一个β-卷心折叠，结构域F由16个β-折叠组成两个平行的β-折叠片；L-鼠李糖分别结合在结构域A和D中，结构域A中的L-鼠李糖结合在该酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之间，与周围的氨基酸形成12个氢键，结合后的船型构象被认为是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的过渡态构象；结构域D中的L-鼠李糖结合在β-折叠间，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分别和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氢键，L-鼠李糖的O3、O4位置与一个正二价钙离子形成配位共价键，同时钙离子与该酶通过Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸产生相互作用：Glu636和Glu895是在该α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的关键氨基酸，Glu636在催化过程中提供质子，将其突变后，该酶酶活下降了40倍。通过对α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构的分析发现，该酶有4个结构域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一个（α/α）6的桶状结构，鼠李糖结合在该桶状结构的深沟里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中还发现了一个新的非催化碳水化合物结合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于结构域D，通过钙依赖的方式与L-鼠李糖结合，在用EDTA螯合钙之后，SaCBM67失去与L-鼠李糖结合的功能。通过对179和180位置的氨基酸的突变实验发现，突变后该酶水解阿拉伯树胶的活性大大降低，而对水解芳香基鼠李糖苷的活性影响不大，研究者认为SaCBM67对该菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有着一定的影响。 3展望

微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潜在的应用价值，近年来，对该酶的研究越来越受到学者的关注，从不同水平对α-L-鼠李糖苷酶进行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶产酶菌株的筛选、发酵条件的优化以及酶的分离纯化和性质研究日趋成熟，为产业生产α-L-鼠李糖苷酶酶制剂及α-L-鼠李糖苷酶在食品医药加工工业中的应用提供了一定的参考价值；其次，在分子生物学方面，对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行了克隆，并通过生物信息学分析、基因的表达以及晶体结构的研究，使得对α-L-鼠李糖苷酶的了解进一步深入。这些研究为构建工程菌生产α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶产量，降低目前生产α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理论指导。但目前对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途径、诱导机制和催化机制研究较少，因此，可进一步通过利用分子生物学、结构生物学和计算生物化学等技术，对α-L-鼠李糖苷酶进行更深层次的研究。从分子水平上来研究α-L-鼠李糖苷酶的催化机理，结合定点突变等技术来提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同时，通过计算模拟等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物结合特异性，扩大α-L-鼠李糖苷酶在各生产工艺中的应用范围因为自然分离纯化的酶难以满足苛刻的工业生产过程，所以酶的改造成为一种非常有效的替代途径，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构信息，加深对其结构和功能的认识，为α-L-鼠李糖苷酶定向进化和改造奠定理论基础：

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