甲氨蝶呤/锌铝层状双氢氧化物的合成以及生物效应探究

1 引言

水滑石类化合物包括水滑石和类水滑石, 因其主体一般由两种金属的氢氧化物构成, 故又称为层状双金属氢氧化物. LDHs的化学通式可表示为: [M2+1xM3+x2][An]x/nmH2O,其中 M2+表示+2 价金属离子, M3+表示+3 价金属离子,A 表示层间阴离子, m 为层间水分子的摩尔数[ 1].LDHs 的层间阴离子具有可交换性, 因此, 可将各种阴离子, 如有机、无机、中性分子、酶及其他生物药物分子等组装到 LDHs 层间, 进而得到具有不同性能的复合材料. 此外, LDHs 独特的层板结构能够有地保护插入ฅ其中的分子或离子. 大量的研究证明,药物/LDธHs 纳米复合物的合成不仅可以降低药物的毒副作用, 提高药物的安全性、有效性, 还可提高药物的溶解度和稳定性, 控制药物释放速率. 因此, 近年来, 将客体药物组装到 LDHs 层间制得药物/LDHs纳米复合物的研究受 ツ到生物、医学和材料界的广泛关注. 北京化工大学段雪等研究了多种生物药物插层 LDHs 层间的结构、性能以及药物释放的缓释性能等. 山东大学侯万国等选用萘普生为模型药物分子, Zn-Al-LDHs 为载体, 合成了萘普生/LDHs, 又采用结构重组法制备了非离子型、水溶性差的抗癌药物喜树碱/LDHs.

甲氨蝶呤是一类抗叶酸类抗肿瘤药, 主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA 的合成 , 从而遏制肿瘤细胞的生长与繁殖 .MTX 是治疗类风湿关节炎的主要药物, 近年来也被用于治疗系统性红斑狼. 但 MTX 具有体内半衰期短、组织分布广泛、不良反应严重及器官靶向性差等缺点. 研究表明, MTX 组装到 LDHs 层间形成 MTX/LDHs 纳米复合物后, 不仅能有效改善这些不足, 而且能明显增强药物的稳定性, 提高药效. 目前, 制备 MTX/LDHs 的方法有共沉淀法、离子交换法、机械化学法、水热法、成核-晶化法和焙烧还原法等.Choy 等采用共沉淀法成功合成了MTX/LDHs纳米复合材料, 并分别将 MTX 和 MTX/LDHs作用于人类骨肉瘤细胞. 结果发现, MTX/LDHs 抑制肿瘤细胞生长的效率远远高于纯 MTX, 且体内释放半衰期延长、器官靶向性增强, 同时证明了 MTX/LDHs 在小剂量时仍具有很高的药效, 其药效比纯MTX 高 5000 多倍.

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

硝酸锌26H2O, A.R., 广东汕头市西陇化工厂有限公司), 硝酸铝39H2O, A.R., 上海新宝精细化工厂), 氢氧化钠, 氨水, 乙醇, 磷酸二氢钾, 甲氨蝶呤, 二甲亚砜, 小牛血清, DMEM 培养基, MTT, 胰蛋白酶. 实验用水均为去离子水.

2.2 改进的共沉淀法合成 MTX/LDHs 纳米复合物

称 取 0.8924 g Zn29H2O 和 0.5627 gAl39H2O 并溶于乙醇/水溶液中,配成混合盐溶液 A; 称取一定量的 MTX 溶于8 mL 5%的氨水中, 配成溶液 B; 将 B 溶液转移至三颈烧瓶中, 恒定 60℃温度下磁力搅拌并通入 N2, 采用 pH 下降法以 0.1 mL/s 的速度滴加溶液 A, 用 25%的氨水调节混合溶液的 pH 为 8.5, 60℃下反应1 h. 最后, 用去离子水和乙醇交替离心洗涤 3 次. 合成的产物放至 50 mL 的高压反应釜中, 经100℃、24 h 的水热处理后即制备出 MTX/LDHs 纳米复合物. 作为对比, 采用同样方法, 不加药物合成了Zn-Al-LDHs 母体.

2.3 缓释性能的研究

准确称取 0.01 g MTX/LDHs 溶解在 50 mL pH1.2 的 HCl 溶液中, 用移液管取容量瓶中 5 mL 溶液置于 50 mL 容量瓶中, 加入 45 mL HCl 定容, 所得溶液浓度约为 20 g/mL. 用紫外-可见分光光度计在 306nm 处测定其吸光度, 并根据标准曲线计算 MTX 浓度,求出载药量. 再根据载药量计算缓释实验所需要的MTX/LDHs 纳米复合物的量, 称取后溶解于 pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中, 在 37 0.5℃下恒温搅拌. 于预设定的时间间隔内, 取 3 mL 溶液高速离心分离, 取上清液用紫外-可见分光光度计在306 nm 处测量其吸光度, 根据标准曲线计算出相应的 MTX 浓度和释放率, 并绘制出 MTX 的累积释放曲线.

2.4 采用 MTT 法初步研究 MTX/LDHs 对肺癌A549 细胞的增殖抑制作用

人肺癌细胞株 A549 购自上海细胞库, 用含 10%小牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素的 DMEM 培养基, 于 37℃、5% CO2恒温培养箱内培养. 将人肺癌A549 细胞接种于 100 mL 的培养瓶中, 培养基为含有10%小牛血清的 DMEM, 置于 37℃、5% CO2恒温培养箱内培养箱孵育, 细胞为贴壁生长, 用显微镜观测待细胞长满培养瓶的 70%~80%, 用 0.25%的胰蛋白酶消化, 传代. 用 10% DMEM 稀释细胞悬液, 并接种到 96 孔板, 每孔体积 100 L. 正常培养 24 h 后吸走废液, 加入不同浓度的MTX和MTX/LDHs , 每组设 6 孔重复, 对照组加 100 L DMEM . 分别培养 24 h 后弃除 96孔板中的残药和 DMEM, 每孔加入新鲜 DMEM 90 L 和 MTT 10 L , 继续培养 4 h 后, 终止培养.

3 结果与讨论

3.1 FT-IR 分析

在不同 R 值条件下合成的 MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物的红外光谱图, 分子振动光谱常用于研究客体分子与主体层板、层间水等之间的作用力.从图中可看出, 所有复合物红外峰的峰型与峰位非常相似, 且与 MTX 红外峰位置基本相同. 此外, 母体 NO3-LDHs 的红外光谱也标示于图中. 可以看出,NO3-LDHs 的红外谱图与复合物有明显不同. 对于母体 LDHs, 3430 cm1处的峰对应 LDHs 层板上和层间水分子的 OH伸缩振动, 1637 cm1处的峰对应层间水分子的变角振动, 而 1386 cm1处的峰则对应NO3的吸收振动. 对于 MTX/LDHs 复合物, 1386cm1处的吸收峰明显变弱, 说明 MTX 已经取代了层间大部分的 NO3, 这说明, 在反应中 NO3与层板间强烈的静电作用使部分 NO3不易除去. MTX 的红外光谱中, 1638 和 1508 cm1处的峰分别对应 COO的不对称及对称伸缩振动, 当 สMTX 插层到 LDHs 层间后, 这两个峰分别红移至 1614 和 1450 cm1处. 这是因为在碱性环境中, MTX 末端的COOH 电离为COO, 带负电的 MTX 阴离子与带正电的 LDHs 发生强烈的静电作用使得 COO的不对称和对称伸缩振动峰发生了红移.ฌ 以上结果均表明, MTX 组装到LDHs 层间后, 二者之间的相互作用使得 MTX 吸收峰位置和强度均发生了变化.

4 结论

本文采用共沉淀法合成了不同的 MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物, 并考察了其缓释性能和癌细胞活性检测. 研究结果表明, 合成粒子的粒径会随 R 值的增大而减小. 缓释实验结果表明, 4 种样品均具有明显的缓释性能, 缓释曲线平稳. 用 modified Freundlich模型和 parabolic-diffusion 模型进行了分步动力学模拟, 分析结果表明, MTX/Zn-Al-LDHs 纳米复合物最初的释药过程属于表面药物的扩散, 随后的释放属于粒内扩散占主导的多相扩散过程. 生物细胞活性实验的研究表明, MTX/LDHs 较纯的 MTX 具有更好的抑制癌细胞增殖的作用, 在一定范围内, 其抑制作用随着粒径的减小而增强.