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第一篇:《通过OsmiR156对OsSPL14的调控确定水稻的理想的株型》

通过OsmiR156对OsSPL14的调控确定水稻

的理想的株型

提高作物产量是现代农业的一个重大挑战。新的植物品种，又被称为培育理

想株型（IPA），已经被提议用来作为一种手段，通过它提高现有高产品种水稻的产量

潜力。在这里，我们报告的克隆和数量性状位点半控制， IPA1（理想株型1），其中

水稻株型有了令人满意的改变，并且大幅度提高了水稻的产量。IPA1的数量性状位点

编码OsSPL14（SOUAMOSA启动子结合蛋白—LIKE14）并且由小RNA（miRNA）在体内调

节的。我们研究了关于OsSPL14扰乱OsmiR156（直接调节OsSPL14）位点的突变体，

培育了一个分蘖数减少，增强抗倒伏能力并且提高粮食产量的一个'理想'水稻品种，。

我们的研究表明，OsSPL14可能有助于通过减轻培育新的优良的大米品种的困难来提

高水稻产量。

理想水稻品种对于粮食产量非常重要，并且取决于株高，分蘖数和分蘖角度，

穗的形态。理想株型（IPA）的重要特点包括低分蘖数且有较少的无效分蘖，每穗比目

前种植品种有更多的籽粒，粗而结实的茎。然而，对于形成理想珠型的分子机制和增

加潜在产量（的机制）还待进一步探讨，以及应用基因来改善水稻的植株形态是非常

有限的。不同的水稻品种具有截然不同的植株形态，因此具有不同的潜在产量。相对

于目前栽培稻品种，包括籼稻品种, 印度品种Taichung Native 1（台农一号），粳稻

边界植物少蘖粳（SNJ）的植物构型体现了理想株型的的原则，包括株高，分蘖数和穗

形态（图1A） 。回交杂种SNJ,如台农一号或Hui7（一粳稻）实验表明株高，分蘖数

和穗形态在回交后代不分离，这意味着与台农一号或Hui7和SNJ在株型（IPA）差异

可能是由单一基因控制的。因此，我们指定SNJ的形态作为IPA1（理想株型1）. 遗

传分析表明，IPA1是不完全显性的，规定显性杂合植株（OsSPL14IPA1/ipa1）介于纯

合植株OsSPL14IPA1/IPA1和OsSPL14ipa1/ipa1（补充图1）。

为了方便的评价表型，我们选择分蘖数作为(理想株型)IPA1的决定特征。利

用由SNJ和TN1回交后代形成的110 株B2F2植株品种，我们发现了最大的数量性状位点（QTL）定位效应，这解释了qTn8分蘖数有29.9％的变动（的原因）。 qTn8被确定在8号长臂染色体上的RM149和RM1345标记（位点）之间（图1b，c），这是最有可能和以前报道的确定水稻分蘖数的3，4的QTL一样。为了克隆以IPA1位点基因，5500株拥有与TN1相同分蘖数的BC2F2植株通过发达的分子标记技术确认了表型和基因型（补充表1）。

我们缩小了包含IPA1位点（范围）----在M4和M5之间约78 kb（图1天），spl蛋白。

其中包含12个预测基因或ORF（开放阅读框）（图1e和补充表2，见网址）。在SNJ中的12个基因序列分析表明只有第三个外显子基因OsSPL14 (LOC_Os08g39890; RAP ID Os08g0509600)的一个点突变被比作是大米多样性（的原因）。这个核苷酸的替换将导致在SNJ中由亮氨酸变为异亮氨酸（图1楼及辅助图。2）。此外，Ri22，粳稻系表现出类似SNJ的特性，还发现在OsSPL14周边相同的突变，而没有在台农一号，93-11或中华11水稻品种发现此突变位点。我们发现OsSPL14的表达水平由点突变影响（补充图3）。

为了确定是否OsSPL14引起IPA1 的QTL(数量性状位点)，我们通过培育的

转基因植物表达不同水平的OsSPL14在Nipponbare和Ri22系，粳稻系适合做基因转化确认测试。我们导入了携带OsSPL14基因（指定的gOsSPL14）的质粒，其中携带有spl蛋白。

7.2 kb的基因组DNA片段，在Nipponbare中（见网上方法）。gOsSPL14转基因系的减少了分蘖，增强茎秆和穗分支和增加粮食产量（补充图。4）。相比之下，在R22中OsSPL14的 RNA干扰（RNAi）的转基因植物的产生更多的分蘖并且株高，茎秆直径，穗分行和穗粒数都显著的减少（补充图。5）。因此，我们认为OsSPL14是理想株型主要基因。

SPL的基因都有一个高度保守的DNA--结合域（SBP域），代表着一种特定的

属，明确的转录因子包括控制开花时间调控的参与，表型转变，叶分化和其他高等植物发育进程5 - 18。在水稻基因组，有19个SPL基因和OsSPL14（也称为IPA1和WFP）是和拟南芥SPL9最相似的（参考文献8）（补充图。6），也表明(他们)参与调节（第一个叶原基的形成与第二个叶原基的形成之间的)间隔期的长度和叶子尺寸15，18。 OsSPL14定位于细胞核（图1g），和转录因子的作用是一致的。RNA的原位杂交显示，OsSPL14是主要在茎尖的生长（图2a）和生殖（图2b）的阶段表达。它也在植物的初spl蛋白。

级和次生枝高度表达（图2c的）。

以往研究表明，11个OsSPL基因一般认定是OsmiR156的作用目标（参见8），

一个miRNA有19 到 25 个单链碱基对组成的非编码的RNAs19家族成员公认的目标。生物信息学分析表明，OsSPL14有OsmiR156在编码区域的互补基因（补充图。2）。要确定OsSPL14是否可通过OsmiR156在体内调节，我们利用RNA连接酶映射介导的快速的扩增OsSPL14 OsmiR156指定位点cDNA末端（RLM - RACE）技术。随机选择14个克隆测序结果显示，有13个无性系5'端在目标站点的OsmiR156中部地区的裂解片段，表明OsSPL14可以精确切割在体内OsmiR156（图.2d）。

在不同的水稻组织中OsSPL14和OsmiR156的表达模式显示实时PCR和miRNA

的印迹分析表明，OsSPL14高度的在茎和茎尖表达，这与OsmiR156在体内的表达模式互补（图2e， f）。一般的， OsmiR156的过度表达导致OsSPL14的转录大幅下降（补充图，7a），而中断OsmiR156的表达（过度的MIM156的表达）会导致OsSPL14的转录有显著的增加（补充图，7b）。这些结果表明，OsSPL14是由OsmiR156调节的，并在体内指导定向分裂。

小分子RNA通过在植物体内转录分裂和在动物体内主要通过转录阻止来调节

目的基因起到重要作用。最近的研究还表明，在更高等的植物中通过miRNA的翻译抑制目标（基因）普遍存在。要确定的分子机制，通过OsSPL14在体内被OsmiR156调节，我们使用RT – PCR测定杂合子（OsSPL14IPA1/形式ipa1）植物产物裂解位点附近的序列，并发现完整的mRNA的存在主要是OsSPL14ipa1（图3A）。为了证实这一点，我们进一步测序了37个来自于RT - PCR产物的克隆，并且发现33个克隆存在

OsSPL14ipa1。这些结果表明，在SNJ中的OsSPL14的点突变扰乱阻止了通过OsmiR156的OsSPL14的转录。

我们培育携带OsSPL14IPA7m -绿色荧光蛋白转基因的转基因绑腿跑植物，其中有7

个与 OsmiR156不匹配位点，但没有引起任何氨基的变化（图3b）。该OsSPL14IPA7m - GFP转基因植株表型与OsSPL14ipa1 – GFP植株非常相似，它们都拥有比

OsSPL14IPA1-GFP植株更加不好(severe)的表型，表明对于OsSPL14扰乱OsmiR156断裂即使没有改变导致氨基酸序列，而导致SNJ植株表型的变化。为了研究点突变是否

扰动miRNA—抑制OsSPL14的转录，我们用质粒OsSPL14ipa1（gOsSPL14ipa1）和OsSPL14IPA1（gOsSPL14IPA1）在转基因植物中测量OsSPL14蛋白水平。我们发现，gOsSPL14ipa1 - 1转基因植株的蛋白水平当与gOsSPL14IPA1-2 和gOsSPL14IPA1-3相比都有显着提高，虽然在gOsSPL14ipa1 – 1中 mRNA水平比在gOsSPL14IPA1 – 3低（图3c，d ），表明，在大米中OsmiR156中的点突变—与OsSPL14互补位点扰乱OsmiR156--指导转录停止和转录抑制。

为了评估OsSPL14潜力的应用来（选择）最有效的稻米形态并且最终提高水

稻产量，我们在Hui7遗传背景培育了一个近等基因系（NIL）它包含OsSPL14ipa1的等位基因。近等基因系（NIL） OsSPL14ipa1植株结果显示与近等基因系（NIL0 OsSPL14IPA1植株有转录和蛋白的积累的增加（附表，8）相对于近等基因系

OsSPL14IPA1植株， OsSPL14ipa1植株更高（图4a和图补充图，9a），并且分蘖少（图4a和补充图，9b），密穗（图4B）及强壮的秆（图4c和补充图，9C）。深入研究这些特性表征显示，在近等基因系OsSPL14ipa1植株中减少分蘖数是由于(第一个叶原基的形成与第二个叶原基的形成之间的)间隔期的时间长。（补充图， 10a）。跨节的茎秆横截面显示近等基因系（NIL）OsSPL14ipa1植株比近等基因系OsSPL14IPA1植株拥有更多的维管束和更多的厚壁组织细胞（图4d和补充图，10b）。一般，近等基因系

OsSPL14ipa1植株茎机械强度与NIL OsSPL14IPA1植株相比明显增加（图，4e）。更重要的是，统计分析表明，近等基因系OsSPL14ipa1植株穗产生更多初生和次生分枝（图4f，g）和更多的谷粒（图4h）。千粒重由NIL OsSPL14IPA1植株的27.2增加至NIL OsSPL14ipa1 植株的克（图4i）。

理论上，近等基因系（NIL） OsSPL14ipa1植株的粮食单穗产量平均增加到

6.5克相对于近等基因系（NIL）OsSPL14IPA1的4.6克（图4j）。把OsSPL14ipa1等位基因导入到秀水11（XS11），一种粳稻品种在中国南方耕种，在测试区增加了大约10％粮食产量（表1）。这些结果表明，OsSPL14是一种多效基因，似乎赋予有少的不育穗的理想水稻株型，提高每穗粮食产量和提升抗倒伏能力。两者合计，我们的研究结果表明，OsSPL14是水稻株型的一个重要的半显性调节器。 OsSPL14可能有助于促进基因工程和分子培育水稻品种使达到更高的潜在产量。

方法

在线方法

植物材料。在粳稻背景SNJ和Ri22携带OsSPL14ipa1等位基因和有类似的植物结构与在粳稻和籼稻系Hui7品种台农一号与Ri22和Ri22有不同株型。从Hui7 ×SNJF1代植株回交4次生成Hui7发育成了了近等基因系Hui7（NIL OsSPL14ipa1）。为了培育一个优良的拥有OsSPL14ipa1等位基因的水稻品种，从XS11 ×SNJ的F1植株与XS11回交三次生成BC3F1种。从BC3F2代，NIL XS11 OsSPL14ipa1被用来研究产量而培育。

构建了遗传转化。为了构建gOsSPL14IPA1质粒转化，一个7.2 kb的DNA片段含有1117 bp的上游序列，整个OsSPL14IPA1和2326 bp的下游序列以及Nipponbare的基因组DNA用gIPA11F和gIPA11R做引物（补充表1），然后用gIPA11F和gIPA11R（补充表1）到双元载体pCAMBIA1300上植物来基因转化。KpnI-XbaI–的消化片断被整合到二元载体AHLG.上。OsSPL14ipa1-GFP 和OsSPL14IPA17m-GFP的突变体被通过引物gipa11F, gipa11R 和 7mIPA1GFP1F, 7mIPA1GFP1R（补充表1）。

为了构造miRNA156OE质粒，PCR扩增片段扩增，从全长cDNA克隆AK110797

用引物156OE1F和156OE1R（补充表1）的克隆到的BamHI - AK110797的双重载体pTCK303上。该MIM156的结构是根据以往报告的方法，并且PCR片段到的BamHI-SacI–的载体pTCK303上。

cDNA 5'末端快速扩增法。cDNA 5'末端快速扩增法电泳每形成根据事先报告方法。简单地说，总RNA分离于2周龄 NIL OsSPL14IPA1幼苗,使用的是TRIzol试剂

（Invitrogen公司）。该OsSPL14基因确切的特异性引物在第一和第二轮PCR产物分别是IPA1 - 1570R和IPA1RT1R（补充表1）。第二次PCR产物纯化和的再克隆到凝胶到pGEM - T Easy载体（Promega公司）进行测序。

第二篇:《人分泌型磷脂酶A2(sPLA2)ELISA试剂盒说明书》

人分泌型磷脂酶A2(sPLA2)酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

厦门慧嘉生物科技有限公司

本试剂盒仅供研究使用 预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)含量。 实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中sPLA2水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入sPLA2抗原、生物素化的抗人sPLA2抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的sPLA2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1. 酶联板：一块（96孔）

2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，

然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2,000 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释2,000 pg/ml，1,000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。

如配制1,000 pg/ml标准品：取0.5ml 2,000 pg/ml 的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。

4. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预开心的一天日记先计

算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶

液A。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。

9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

标本的采集及保存

1. 细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2. 血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准

品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul（取1ul检测溶液A加99ul

检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟形容美丽的字。spl蛋白。

3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干

（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4. 每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100ul，37℃，60分钟。

5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干

（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有

明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底

物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行

检测。

注：

1. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。

测量时先用此孔调OD值至零。

2. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。

3. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B

工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

4. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需 要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测重组或天然的人sPLA2，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

《朝花夕拾》读后感

2. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6. 底物请避光保存。

检测范围：

31.2 pg/ml - 2,000 pg/ml

说明

1. 试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时，仅适用于部分试剂）；2-8℃（频繁使用时）。

2. 有效期：6个月

3. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何

影响。

5. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

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